基因编辑脱靶检测：我们还没摸透CRISPR剪刀的刃口

去年深秋在南京紫金山下的实验室，我见过刚跑完三代测序的凝胶图——条带歪歪扭扭，本该亮在靶位点的带型旁边，多了两团模糊的影子。那是我们做了三个月的小鼠胚胎编辑样本。本来预期的单碱基替换，偏偏在非目标区段切了两刀。没人敢直接往下做移植。

那些被漏掉的剪切点，从来不是小问题

早期做基因编辑的人，大多都有过类似的经历。一开始我们总觉得，脱靶就是剪刀找了和靶序列长得像的地方下了手——毕竟Cas酶识别靶序列靠的是碱基互补配对，差几个匹配不上，总该不会切吧？

这个想法骗了我们好多年。

传统的同源序列预测模型，最多能覆盖不到30%的实际剪切位点。2015年前后整个领域都在靠计算机列潜在脱靶位点，然后挨个扩增测序，结果有课题组对着小鼠全基因组做无偏好检测的时候才发现，超过七成的实际剪切位点，和靶序列的同源性低到连预测软件的阈值都够不上。

说起来好笑，我们前两年还信过某款商业软件的预测报告，拿着它列的12个潜在位点挨个测，测完发现样本里有三个剪切点根本不在列表里。当时整个实验室的人对着测序数据愣了半小时——这相当于你拿个筛子捞鱼，捞了半天发现筛子眼全在水外面。

这些漏掉的位点从来不是无关紧要的噪音。2021年有个临床I期的基因编辑项目，本来用在造血干细胞上的gRNA，被发现会在一个抑癌基因的内含子区域产生低频率的剪切，直接导致整个项目暂停了六个月。你永远不知道那个藏在非编码区的剪切点，会不会刚好碰掉一个调控元件，会不会在几年后诱导出癌变。

从“找相似”到“抓现行”，方法绕了十年弯路

意识到预测模型靠不住之后，整个领域花了差不多五年时间，把检测思路从“按图索骥”改成了“无偏好抓现行”。

最早出来的GUIDE-seq算是个转折点。它靠把一种短的双链寡核苷酸转进细胞，只要基因组里出现了双链断裂，这个寡核苷酸就会插进去，最后把所有插了标记的位点捞出来测序——等于给所有剪切点装了个摄像头。

但这个方法也有致命的毛病。

寡核苷酸要转进细胞本身就是个门槛。对于细胞系样本还好，转染效率能到70%以上，测出来的结果基本靠谱。要是换成体内直接编辑的组织，比如小鼠的肝脏、大脑，寡核苷酸根本递不进去，摄像头等于白装。我们去年用GUIDE-seq测细胞系样本，同一种gRNA找出来17个剪切位点，换成体内注射的小鼠肝脏样本，只找到了4个。一开始还以为是体内编辑效率低，后来才发现是肝细胞的转染效率不到5%——大半的剪切点根本没被标记上。

后来又出来了CIRCLE-seq、Digenome-seq这些体外检测方法，把基因组提出来打断，在试管里加Cas酶和gRNA，看哪些片段被切了。但体外的基因组是裸露的，和体内折叠成染色质的状态完全不一样，很多位点在体内被组蛋白挡住，根本碰不到，体外测出来的脱靶谱，到了体内直接打对折。

现在大家普遍更倾向于用全基因组深度测序做验证。基于全基因组测序的无偏好检测，现在已经能做到单碱基分辨率下的结构变异识别，不需要任何标记，不管是细胞样本还是组织样本，只要提了基因组就能测。

但贵。

我们上个月测一个临床前的样本，30X的全基因组测序跑出来什么脱靶都没发现，后来加到200X的深度，才在一个内含子区域找到了一个频率只有1.2%的剪切位点。那一笔测序费，够买三个月的分子生物学试剂。

我们现在能测出所有脱靶吗？显然不能

很多人觉得现在技术成熟了，只要测够深的测序，就能把所有脱靶都找出来。真不是。

最早的Cas9介导的双链断裂脱靶，现在的方法基本能覆盖个七七八八。但这两年火起来的单碱基编辑、Prime编辑，根本不产生双链断裂，之前的那些找双链断裂的方法，全没用。

比如胞嘧啶单碱基编辑器CBE，之前有研究发现它会在RNA水平产生大量的随机脱氨基突变，还有的会在基因组里产生低频率的单碱基替换，这些变化不会形成双链断裂，之前的检测方法根本抓不到。你要是只测DNA的双链断裂位点，等于只查了小偷撬锁的痕迹，人家翻窗户进来你根本没看见。

更麻烦的是，脱靶的风险从来不是静态的。gRNA的序列、Cas酶的浓度、编辑的组织类型、甚至个体的基因组差异，都会改变最终的脱靶谱。

我们之前和医院合作过一个T细胞编辑的临床前项目，用同一个gRNA在三个健康供体的T细胞里做编辑，最后测出来的脱靶位点重合率不到40%。其中一个供体的基因组里刚好有个SNP，和gRNA的部分序列刚好互补，凭空多出来一个之前从来没见过的剪切位点。当时整个项目组都傻了——这意味着你在实验室用细胞系测出来的脱靶谱，到了不同病人身上，完全可能是另一套。

现在FDA对于基因编辑的临床前申报，已经要求必须用至少两种无偏好的脱靶检测方法，不能只靠计算机预测。但到底要测到什么深度才算够？测到的脱靶位点在非编码区，到底要不要紧？如果那个位点刚好是个还没被注释的增强子，会不会导致长期的基因表达异常？这些问题现在都没有标准答案。

说实在的，我现在每次拿到新的脱靶检测报告，都不会像前几年那样直接松口气。总觉得还有什么东西藏在数据后面——毕竟我们现在能看到的，只是剪刀切出来的明面上的口子，那些没被切开的、只是稍微碰了一下的位点，会不会在几个月甚至几年之后出问题？没人知道。

上个月去上海开学术会，听一个老师讲他们新开发的高保真Cas变体，脱靶率比野生型低了两个数量级。我当时在底下记笔记，突然想起三年前在南京实验室对着凝胶图愣神的那个下午。

其实路还长。

但至少我们现在知道，要找的不是那几个看得见的条带，是整个基因组里所有可能被碰到的地方。